当HIV-1 Env三聚体与细胞表面受体CD4结合后，HIV-1就启动了其对CD4⁺T细胞的感染之路。CD4的结合会导致Env中gp120亚基发生构象变化，在此基础上，共受体CCR5或CXCR4得以结合。受体和共受体的结合进一步导致Env gp41亚基的构象变化，从而驱动病毒和宿主细胞膜的融合¹。在过去的结构生物学研究中，研究者曾观察到Env三聚体完全开放和部分开放的状态²，但目前尚不清楚这种部分开放的Env三聚体构象是否是整个构象变化过程中真正的中间状态。

图1. HIV进入宿主细胞的过程¹

通过探究HIV-1 Env三聚体在天然的膜环境中与可溶受体的相互作用，研究者获得了更多Env与CD4相互作用的信息。如，通过cryo-ET直接对病毒颗粒进行成像，研究者观察到了天然的Env三聚体以及Env三聚体被CD4打开的结构，这一结构最初的分辨率约为20ų，随后达到了9-10Å^4,5。此外，还有许多研究表明，HIV-1的入侵始于Env与单个CD4的结合，随后额外的CD4分子和共受体才能被募集。

在利用具有高密度Env三聚体的HIV-1Bal颗粒^4,5(经Aldrithiol-2灭活) 与表达有CD4受体合CCR5、CXCR4共受体的质膜囊泡混合后，研究者对样品进行了快速冷冻，并使用cryo-ET进一步探究HIV-1 Env-CD4在膜原位的相互作用。在重构的图像中，可观察到HIV-1Bal颗粒与质膜囊泡相互作用的界面 (图1a,b)，且有部分Env三聚体呈簇状排布 (图1c,d)，此外，研究者还观察到了全长CD4分子与Env之间的相互作用 (图1d,f)。

由于较大的囊泡在cryo-ET成像的过程中图像质量较差，研究者在前期研究的基础上进一步对实验体系进行了优化，以期获得更多适用于cryo-ET成像的理想大小 (~150 nm) 的囊泡。利用小鼠白血病病毒 (murine leukaemia virus, MLV) GagPol产生表达有CD4受体的病毒样颗粒 (virus-like particle, VLP) (MLV-CD4颗粒)，并将HIV-1Bal颗粒与MLV-CD4颗粒进行混合，可在电镜下观察到Env与CD4互作所介导形成的膜界面 (图2)，且由于形态的不同，两种颗粒在电镜下可以被明显区分。

在优化后的样品中，Env成簇合成环的现象变得明显，Env三聚体的数量随簇状结构的增大而变多，在环形结构中，三聚体的数量则较少。此外，在小的簇状结构中，膜间距最大化，随着簇状结构的增大，间距逐渐减小，环形结构的膜间距最小 (图2a-g)。通过在有或没有MLV-CD4颗粒存在的情况下对两个Env三聚体之间的弧线距离进行检测，可发现MLV-CD4颗粒存在情况下，短的弧线距离出现的频率明显升高，提示Env三聚体的这种聚集现象与CD4分子存在着一定的相关性。

利用从168套数据中手动挑选得到的约5,700个复合物颗粒进行亚断层平均，研究者得到了HIV-1 Env三聚体结合三个CD4分子的密度图，平均分辨率约15 Å (图3)。该密度图，三聚体呈开放状态，gp120的密度远离中轴，在三聚体的每一个原体中，V1V2环都朝向外侧，与过去报道的可溶性Env三聚体结合CD4分子的结构相一致 (图3)。此外，结构中的一个CD4密度稍好，而另外两个的局部分辨率在整个密度图中最低，提示CD4的结合存在构象上的多样性，结合不同Env聚集模式之间膜间距的差异，研究者认为这种构象上的多样性或许与膜之间的距离有关。

对膜距离进行更进一步地分类可以得到两个不同的亚类：其中一种膜间距较大(约190 Å)，Env只结合单个CD4分子 (图4g)，另一类的膜间距较小 (约140 Å)，Env结合三个CD4分子 (图4m）。由于后者在V1V2环和CD4部位的密度仍然存在多样性，研究者进一步基于CD4进行分类，从而得到了另一个具有两个CD4分子结合亚类 (图4k)。整体上，总共有41%的Env三聚体与一个CD4分子结合，25%与两个CD4分子结合，34%与三个CD4分子结合。

在Env三聚体结合三个CD4分子的结构中，除D1D2结构域以及Env结合区域能够被较好解析外，D3D4结构域也变得清晰可见。三个D3D4结构域沿膜排齐，D2-D3之间的铰链区则较为柔性，这两点使得结合了CD4的Env能够接近宿主的细胞膜。结合前述约190 Å的膜间距，研究者认为CD4必须处于完全展开的构象才能与对侧膜上的Env接触，而CD4的构象变化促进了HIV-1与膜的进一步融合。

为进一步评估过去研究得到的CD4-D1D2结合可溶性Env三聚体的结构 (B41.SOSIP.664、BG505.SOSIP.664、BG505.SOSIP.664结合8ANC195，分别对应PDB 5VN3、6U0L、6CM3)，前两者为完全开放状态，后者为部分关闭状态) 是否与本研究中结合三个Env分子的密度图相吻合，研究者将gp120-CD4-CCR5复合物 (PDB:6MET) 中全长的CD4分子与相应的SOSIP模型组合，通过与本文的密度图进行比对，发现本文的密度图与Env三聚体部分开放的状态吻合得更好 (图5a,b)，而这一结论也在分子动力学柔性拟合 (molecular dynamics flexible fitting, MDFF) 分析中得到了进一步证实  (图5c-e)。

综上，本文通过利用cryo-ET对HIV-1 Env三聚体与CD4分子在膜原位形成得复合物进行分析，发现Env-CD4复合物可以成簇或成环，从而将相对的膜彼此拉近。Env三聚体可结合一个、两个或三个CD4分子结合，从而最终呈现开放状态。结合一个或两个CD4分子得非对称HIV-1 Env三聚体是病毒结合到宿主细胞膜时可被检测到的中间体，这或许对抗体介导的免疫应答和未来疫苗设计具有一定的启示作用。